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高效液相色谱仪测定氨基葡萄糖含量

来源:未知      发布日期:2019-08-14 08:51    |     分享    加入收藏   关注:
高效液相色谱仪测定氨基葡萄糖含量



1  范围
本方法规定了以氨基葡萄糖为功效成分的硬胶囊、软胶囊和片剂包装的保健食品中氨基葡萄糖的测定方法。
本方法适用于保健食品中氨基葡萄糖的含量测定。
本方法第一法紫外分光光度法的检出限为1.5μg。第二法高效液相色谱仪-紫外检测法的检出浓度为4μg /mL。
第一法 紫外分光光度法
2  原理
样品中D-氨基葡萄糖盐酸盐用水溶解,与乙酰丙酮、对二甲氨基苯甲醛试液显色之后,以试剂空白溶液为参比,以D-盐酸氨基葡萄糖为对照品,在525 nm波长处比色测定。
3  试剂和材料
注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T6682 规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1乙酰丙酮(C5H8O2)。 
3.1.2无醛乙醇(C2H5OH)。
3.1.3碳酸钠(NaCO3)。
3.1.4对二甲氨基苯甲醛(C9H11NO)。
3.1.5盐酸(HCl)。
3.1.6石油醚:沸程 30°C~60°C。
3.2 试剂配制
3.2.1 乙酰丙酮试液:取乙酰丙酮2 mL,加0.5 mol/L碳酸钠溶液至50 mL,临用前配制。
3.2.2 对二甲氨基苯甲醛试液:对二甲氨基苯甲醛0.8 g,加无醛乙醇15 mL及盐酸15 mL,摇匀,临用前配制。
3.3 标准品
D-盐酸氨基葡萄糖:纯度≥99.0%。
3.4 标准溶液的配制
3.4.1 盐酸氨基葡萄糖标准储备液(1.0 mg/mL):精确称量105℃干燥4小时至恒重的盐酸氨基葡萄糖对照品10mg,置于10mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,备用。
3.4.2盐酸氨基葡萄糖标准溶液(0.1 mg/mL):精密量取1.0 ml标准储备液,用水定容至10ml,作为标准溶液。
4  仪器设备
4.1  紫外分光光度计:波长525±2nm。
4.2  天平:感量为0.1 mg。
4.3  干燥箱。
4.4  恒温水浴锅。
4.5  离心机:转速 ≥3000 r/min。
4.6  超声波清洗器。
5  分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1片剂、硬胶囊试样
称取已粉碎混合均匀的待测试样(硬胶囊称取混合均匀的内容物)约0.1~0.5g(精确到 0.0001 g),置100mL量瓶中,加水用超声波使其溶解,加水稀释至刻度,摇匀,滤过;精密量取续滤液适量,置50mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。
5.1.2 软胶囊制品
称取混合均匀的油类制品 0.1 g~0.5g (精确到 0.0001 g) 至50 mL离心管中,加入50mL石油醚,轻摇溶解,3000 r/min 离心10 min后,弃去上层溶液,并用氮气吹干,用水将试样全部转移至100mL量瓶中,并用水分次洗涤,合并溶液至量瓶中,超声波使其溶解,用水稀释至刻度,摇匀,滤过;精密量取续滤液适量,置50mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。
5.2 标准曲线的制作
吸取盐酸氨基葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4 、0.6、0.8、1.0、1.2mL对照品溶液,置25mL具塞比色管中,加水至5mL。分别加乙酰丙酮试液(取乙酰丙酮2 mL,加0.5 mol/L碳酸钠溶液至50 mL,临用前配制)1 mL,摇匀,置沸水浴中加热25分钟,取出,用冰水迅速冷却后,加无醛乙醇3.0 mL,60℃水浴中保温10分钟,再加对二甲氨基苯甲醛试液1.0 mL,强烈振摇,继续在60℃水浴中保温1小时,冷却至室温。用分光光度计在525 nm波长处以试剂空白溶液为参比,1cm比色皿测定吸光度值。以D-盐酸氨基葡萄糖质量(μg)为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。
5.3 试样溶液的测定
精密吸取供试品溶液5.0mL,分别置25mL具塞比色管中,加乙酰丙酮试液1 mL,以下按“标准曲线”进行操作,测定供试品溶液吸光度值,从标准曲线査得氨基葡萄糖含量,计算,即得。
6  分析结果的表述
试样中氨基葡萄糖(以盐酸氨基葡萄糖计)含量按式(1)计算:
 
      Ci ×V×F×100
Xi = ..........................................(1)
      m×V0×1000000           
式中:
Xi——试样中氨基葡萄糖的含量,单位为克每百克(g/100g);
Ci——由标准曲线查得测定样液中氨基葡萄糖的含量,单位为微克(μg);
V——被测定样液的定容体积,单位为毫升( mL);
F——被测定样液的稀释倍数;
V0——样品被测定时的取样体积,单位为毫升( mL);
m——试样的称样质量,单位为克( g);
100——单位转换;
1000000——单位转换。
计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。
7  精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 10% 。

第二法 高效液相色谱仪-紫外检测法
8  原理
试样中的氨基葡萄糖经溶解、稀释、过滤后,使用具有紫外检测器的高效液相色谱仪检测,根据色谱峰的保留时间定性,外标法定量。
9  试剂和材料
注:除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T6682 规定的一级水。
9.1 试剂
9.1.1戊烷磺酸钠(纯度≥99.5%)。
9.1.2乙腈(色谱纯)。
9.1.3石油醚:沸程 30°C~60°C。
9.2 试剂配制
戊烷磺酸钠溶液:称取3.48g戊烷磺酸钠(纯度≥99.5%)用2000mL水溶解,浓度为10mmol/L。
9.3  标准品
D-盐酸氨基葡萄糖:纯度≥99.0%。
9.4  标准溶液的配制
9.4.1 盐酸氨基葡萄糖标准储备液(1.0 mg/mL):精确称量105℃干燥4小时至恒重的盐酸氨基葡萄糖对照品10mg,置于10mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,备用。
9.4.2盐酸氨基葡萄糖标准溶液:吸取盐酸氨基葡萄糖标准储备液0.5、1.0、1.5、2.0、4.0mL,置10mL量瓶中,用流动相定容至10ml,作为标准溶液。
10  仪器设备
10.1  高效液相色谱仪:附紫外检测器或DAD检测器。 
10.2  天平:感量为0.1 mg。
10.3  干燥箱。
10.4  超声波清洗器。 
10.5  离心机:转速 ≥3000 r/min。
11  分析步骤
11.1 试样制备
11.1.1 试样处理
见5.1.1。精密量取续滤液适量,置50mL量瓶中,加流动相稀释至刻度后,摇匀,经0.45μm滤膜过滤后即得供试品溶液。
11.2 色谱参考条件
11.2.1 色谱柱:Cl8 4.6mm×250mm不锈钢柱。
11.2.2 柱温:35℃。
11.2.3 检测波长:192nm。
11.2.4 流动相:乙腈+戊烷磺酸钠溶液=10+90。
11.2.5 流速:0.8mL/min。
11.2.6 进样量:10μL。
11.3 标准曲线的制作
将10 μL的标准系列各浓度溶液(9.4.2),注入高效液相色谱仪中,测得相应的峰面积,以标准溶液浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线 (标准溶液液相色谱图见附录 A 中图 A.1 )。
11.4 试样溶液的测定
将10 μL的试样待测液(11.1.1)注入高效液相色谱仪中,以保留时间定性,测得峰面积,根据标准曲线得到待测液盐酸氨基葡萄糖的浓度(样品溶液液相色谱图见附录A中图A.2)。

12  分析结果的表述
试样中氨基葡萄糖(以盐酸氨基葡萄糖计)含量按式(2)计算:
 
      Ci ×V×F×100
Xi =   ..........................................(2)
        m×1000000           
式中:
Xi——试样中氨基葡萄糖的含量,单位为克每百克(g/100g);
Ci——由标准曲线查得测定样液中盐酸氨基葡萄糖的含量,单位为微克(μg/mL);
V——被测定样液的定容体积,单位为毫升( mL);
F——被测定样液的稀释倍数;
m——试样的称样质量,单位为克( g);
100——单位转换;
1000000——单位转换。
计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字。
13  精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 10% 。 



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