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高效液相色谱仪性能的测试方法

来源:未知      发布日期:2019-12-24 08:47    |     分享    加入收藏   关注:
高效液相色谱仪性能的测试方法



一、范围 
本标准规定了高效液相色谱仪主要性能的测试方法。
 
本标准适用于高效液相色谱仪(HPLC)、超高效液相色谱仪(UPLC)。
 
本标准测试方法分为单元部件和仪器整机两部分。
 
二、规范性引用文件 
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改版)适用于本文件。
 
GB/T 11606-2007 分析仪器环境试验方法          GB/T 26792-2011 高效液相色谱仪
 
GB/T 25472-2010 色谱数据工作站         GB/T 30433-2013 液相色谱仪测试用标准色谱柱
 
GB/T 32267-2015 分析仪器性能测定术语
 
GB/T 9008-2007 液相色谱法术语 柱色谱法和平面色谱法
 
JJG 705-2014 液相色谱仪检定规程           GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法
 
三、条件要求 
3.1 仪器工作条件
 
环境温度:15℃~35℃;
 
相对湿度:20%~80%;
 
供电电源:电压 220 V±22V,频率 50 Hz±0.5 Hz,并接地良好;
 
室内避免易燃、易爆和强腐蚀性气体及强烈震动、电磁干扰,有良好的通风装置。
 
3.2 试验条件
 
试验用计量仪器、仪表和玻璃器皿等均按有关规定,经计量检定单位检定合格并满足量程和精度的要求;
 
标准溶液与试剂:标准溶液应使用满足相关标准的有证标准物质,并按照相关要求配制,各种试剂应使用优级纯或分析纯。 
 
四、单元部件性能指标的测试
4.1 恒流泵
 
4.1.1 密封性
 
4.1.1.1 设备与试剂
 
高压截止阀一个,耐压不小于仪器压力上限 120%;精密压力表一个,量程不小于仪器压力上限的 120%,0.4 级;三通一个;秒表一块,分度值不大于 0.1 s。
 
纯水:二次蒸馏水,满足《GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法》中一级水要求,以下同。
 
4.1.1.2 测试方法
 
通过三通将恒流泵、高压截止阀和精密压力表连接,恒流泵最高压力设定为仪器压力上限90%处。以纯水为流动相,待系统排出气体,流量设置为 0.1 mL/min;运行仪器,将高压截止阀处于截流状态,压力将逐渐上升,达到仪器压力上限 90%时,停止运行;记录此时压力表示值 p1,保持 10min 后,记录压力示值 p2。按式(4-1)计算压力降。
 
4.1.2 流量准确度与精密度
 
4.1.2.1 设备与试剂
 
秒表一块,分度值不大于 0.1 s;带探针数字温度计一支,分度值不大于 0.1℃;分析天平一台,根据流量大小选择合适载荷,测试质量控制在天平载荷的 60%左右,准确度不低于 II级,实际分度值不大于 0.1 mg;背压装置一个,在设定流量下可提供(8±2)MPa 背压;合适规格的称量瓶三个。纯水。
 
4.1.2.2 测试方法
 
连接恒流泵入口、出口管路,以纯水为流动相(将数字温度计探针插入流动相内,测定此时流动相的温度),分别设定仪器流量上限的 1%、10%和 50%,调整背压在(8±2)MPa。待仪器运行稳定后,按照表 1 要求收集流动相,采用秒表计时,记录数据。分别按照式(4-2)、式(4-3)计算流量准确度和精密度。
 
注:流量的设定可根据恒流泵的流量范围而定,此处以流量上限为10 mL/min为例。
 
注:为方便起见,亦可采用检定合格的液体流量计(精度不低于0.01 mL/min)测试流量准确度与精密度。
 
4.1.3 压力脉动
 
4.1.3.1 设备与试剂
 
精密压力表一个,量程不小于仪器压力上限的 120%,0.4 级;背压装置一个:在设定 1.0 mL/min 流量下,在 0~30 MPa 范围内可调;秒表一块,分度值不大于 0.1 s。纯水。
 
4.1.3.2 测试方法
 
依次连接恒流泵、精密压力表、背压装置入口与出口管路,以纯水为流动相,设定流量为仪器流量上限的 10%,调整背压为仪器压力上限的 20%左右(如仪器压力上限为 40 MPa,则背压调整在(8±2)MPa;如仪器压力上限为 100 MPa,则背压调整在(20±2)MPa)。待仪器运行稳定后,监测精密压力表示值,记录 10 min 内的最大、最小压力值及平均值(每间隔 1 min 读数一次,计算平均值)。按照式(4-4)计算压力脉动率δp。
 
4.2 自动进样器
 
4.2.1 进样准确度与精密度
 
4.2.1.1 设备与试剂
 
 分析天平一台,准确度不低于 II 级,实际分度值不大于 0.1 mg;2 mL 样品瓶若干。纯水。
 
4.2.1.2 测试方法
 
 启动自动进样器,排除管路气泡,清洗进样针,取 2 mL 的进样瓶,加入一定量的纯水,用分析天平称量,记录数据。按表 2 执行取样,每次取样结束后,均对进样瓶进行称量,记录数据。按式(4-5)和式(4-6)进行计算 SS 和 SR,作为进样准确度与精密度*。 

 
4.2.2 线性
 
4.2.2.1 设备与试剂
 
 同 4.2.1.1。 
 
4.2.2.2 测试方法
 
 同 4.2.1.2,依次设定进样体积为 5uL,10uL,20uL,25uL,50uL(如样品环体积为 100 uL),每个体积连续测量三次,记录数据,取算术平均值 m,与对应的取样体积作一元线性拟合校准曲线,得出线性相关系数 r。
 
4.2.3 残留
 
4.2.3.1 设备与试剂
 
高效液相色谱仪系统一套,C18 色谱柱一支(满足《GB/T 30433-2013 液相色谱仪测试用标准色谱柱》标准要求,理论塔板数不低于 18000,以下同)。
 
0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液;85%甲醇水溶液。
 
4.2.3.2 测试方法
 
 将自动进样器连入测试用高效液相色谱仪系统中,采用 C18 色谱柱连接自动进样器出口与检测器入口,启动仪器,设置检测器波长为 254 nm,以 85%甲醇水溶液为流动相,流量设定为 1.0 mL/min,平衡系统。启动进样器,排除管路气泡,清洗进样针,取 2 mL 的进样瓶,加入一定量的 0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液,放入自动进样器托盘指定位置。设置自动进样器参数,进样前后各清洗 1 次(清洗体积为系统体积的 3~5 倍),依次注入 20uL 的 0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液和 100%甲醇溶液。重复测量三次,记录色谱峰面积,取算术平均值,按式(4-7)计算残留量。
 
4.2.4 最小进样时间
 
 在色谱数据工作站上设定分析方法,编辑序列,进样量设为 20uL,选择不洗针模式,点击运行序列,同时用秒表计时,至完成进样,色谱工作站开始采集数据为止,记录此过程的时间为最小进样时间。
 
4.3 色谱柱恒温箱
 
4.3.1 温度准确度与精密度
 
4.3.1.1 设备与试剂
 
 校准过的带探针数字温度计一台,分度值不大于 0.1℃;空色谱柱管一支。
 
4.3.1.2 测试方法
 
 将数字温度计探针放置在一支空色谱柱的中心,将空色谱柱固定在色谱柱温箱内放置色谱柱处,选择 4℃(制冷 1)、室温+10℃,40℃,温度上限的 90%进行测量。按温度从低到高顺序升温,开机加热或制冷 60 min 后,每隔 5 min 记录一次数字温度计显示温度 2,测试五次计算平均值。按照公式(4-8) 和( 4-9)计算温度准确度与精密度。
 
式中:
 
ts —温度设定值误差,作为温度准确度,℃;
 
—为5次测量的平均值,℃;
 
t0—温度设定值,单位为摄氏度(℃);
 
tc —控温稳定性,作为温度精密度,℃;
 
tmax —x次测量最大值,℃;
 
tmin ——n次测量最小值,℃
 
注1:如色谱柱恒温箱具有制冷功能时,才需测试; 注2:亦可通过计算机软件实时检测温度变化曲线,待仪器稳定后,记录温度曲线,计算温度准确度与精密度。
 
4.4 检测器
 
4.4.1 通用性能指标
 
4.4.1.1 静态基线噪声与漂移
 
(1)设备与试剂
 
色谱数据工作站一套,纯水。
 
(2) 测试方法
 
按照表3要求,设定仪器参数,连接测试系统。开机预热60 min后,记录基线60 min;取60 min内平行包络线的中心线的起点与终点的差值作为检测器的基线漂移(如图1所示);选取所记录基线中噪声较大的5 min作为计算噪声的基线,以1 min为界画平行包络线(如图2所示),按式(4-10)计算短期基线噪声。5个包络线宽度的平均值,作为检测器基线噪声。
 
 

图1 基线漂移计算示意图
图2 基线噪声计算示意图
 
 
4.4.1.2 信噪比
 
(1)设备与试剂
 
色谱数据工作站一套;二元梯度系统一套(梯度误差不大于±1%)或1 mL注射器一支;试剂:按照表4配制标准样品。 
 
(2)测试方法
 
将检测器与二元梯度系统,以及色谱数据工作站连接好,按照表3设置仪器参数。开机预热后,以甲溶液为流动相A注入,1.0 mL/min的流量平衡系统,冲洗流通池至示值稳定后归零。然后以乙溶液为流动相B注入流通池,检测器示值稳定后记录响应信号值,重复测试三次,取算术平均值。然后按式(4-11)计算信噪比(S/N),噪声计算方法参照4.4.1.1。
 
.................................... (4-11)
 
式中:
 
S/N—检测器信噪比;
 
H—检测器信号响应值;
 
N—基线噪声。
 
 
 
 
4.4.1.3 线性范围与灵敏度
 
(1)设备与试剂
 
色谱数据工作站一套;1 mL 注射器一支;试样:按照表 4 配制 1 个空白甲溶液,配制 10个系列浓度丙溶液。如紫外-可见检测器配制试样甲溶液:纯水;试样丙溶液:丙酮水溶液浓度依次为 0.1%、0.2%、0.3%、„„、1.0%。
 
(2)测试方法
 
将检测器和色谱数据工作站连接好,按照表3设置仪器参数。开机预热后,用注射器直接向检测池内注入表4甲溶液,冲洗检测池至示值稳定后将检测器回零。然后向检测池内依次注入表4乙溶液,充满检测池并使示值稳定,记录各浓度下的响应信号值,每个浓度重复测试三次,取算术平均值。以前五个浓度点和对应响应信号值作标准曲线,计算出后五点的理论响应值,与对应含量的响应信号值比较,响应信号值刚好大于计算值5%时,认为曲线弯曲,此点浓度作为线性上限CH。 CL值测定(信噪比推算法): 以4.4.1.2测得结果线性推算信噪比为3时对应的浓度,即作为线性下限CL。
 
最后,由CH/CL算出检测器线性范围,CH值测定时标准曲线斜率作为检测器灵敏度。
 
4.4.2 紫外-可见检测器/二极管阵列检测器
 
4.4.2.1 波长准确度与精密度
 
(1)设备与试剂
 
色谱数据工作站一套,1mL注射器一支,氧化钬滤光片或0.4%氧化钬的10%高氯酸溶液:特征波长为242 nm,361 nm,536 nm。另外,亦可参照GB/T 26792-2011,采用0.0601 mg/mL重铬酸钾的0.05 mol/L硫酸溶液(紫外吸收波长标准溶液,特征波长为235 nm,257 nm,313 nm和350 nm)测试。
 
(2)测试方法
 
将检测器和色谱数据工作站连接好,开机预热稳定后,将氧化钬滤光片放置在流通池处或将0.4%氧化钬的10%高氯酸溶液注入流通池进行光谱扫描,重复测试三次,记录并保存,计算谱线波峰的波长示值与特征波长值之差。按照此法依次检验各个特征波长的示值误差,取其中最大值作为检测器波长准确度。计算重复三次中最大值与最小值之差作为检测器波长精密度。
 
4.4.3 示差折光检测器折光响应值准确度
 
4.4.3.1 设备与试剂
 
色谱数据工作站一套;1 mL 注射器一支或恒流泵一台;0.872 mg/mL 丙三醇水溶液(对应响应值为 1×10-4RIU)和 0.436 mg/L 丙三醇水溶液(对应响应值为 5×10-5RIU).纯水。
 
4.4.3.2 测试方法
 
 将检测器和色谱数据工作站连接好,开机预热,首先将纯水注入参比池和样品池,冲洗稳定后归零;然后将 0.436 mg/L 和 0.872 mg/L 丙三醇水溶液依次注入样品池,示值稳定后,记录响应值,重复三次取算术平均值,最后与标准值比较,计算 RIU 与 mV 的对应关系。
 
4.4.4 荧光检测器波长准确度与精密度
 
4.4.4.1 设备与试剂
 
 色谱数据工作站一套,1 mL 注射器一支。
 
 纯水,或者 1×10-4 mg/mL 萘甲醇溶液。
 
4.4.4.2 测试方法
 
 将检测器和色谱数据工作站连接好,开机预热稳定后,向检测池内注入纯水,待检测器示数稳定后,分别设定纯水拉曼光谱的激发/发射特征波长为 350 nm/397 nm,进行激发和发射光谱扫描,重复测试三次,记录并保存光谱图。按照此法依次检验各个特征波长的示值误差,取其中最大值作为检测器波长准确度。计算重复三次中最大值与最小值之差作为检测器波长精密度。
 
另外,亦可采用1×10-4 mg/mL萘甲醇溶液测试,激发/发射特征波长为290 nm/330 nm。
 
五、仪器整机性能指标的测试 
5.1 动态基线噪声与漂移
 
5.1.1 设备与试剂
 
 色谱数据工作站一套,阻尼管或测试用 C18 色谱柱一支(理论塔板数不低于 18000);
 
 甲醇(色谱纯)或纯水。
 
5.1.2 测试方法
 
 按照表 3 要求,设定仪器参数,连接测试系统。启动系统,以甲醇或纯水为流动相,流量为 1.0 mL/min(对 UHPLC,流量为 0.2 mL/min),平衡稳定 60 min 后,记录基线 60 min。然后按照 4.4.1.1 方法,计算动态基线噪声与漂移。
 
5.2 梯度准确度与精密度
 
5.2.1 设备与试剂
 
 色谱数据工作站一套,紫外-可见检测器一台,两通一个,背压装置(10±2)MPa 一套。丙酮(分析纯),纯水;流动相:A,纯水;流动相 B,0.1%丙酮/水溶液。
 
5.2.2 测试方法
 
 通过两通和背压装置将梯度系统与检测器相连,检测器波长设置为 254 nm;色谱数据工作站与梯度系统、检测器信号输出端连接,按图3设置梯度参数。恒流泵总流量设为1.0 mL/min,待仪器稳定后,开始采集数据,得到梯度曲线。测量各种溶液配比时的输出信号值,用公式(5-1)计算各种溶液配比时的梯度误差,取其中最大者为梯度准确度,重复三次,按照公式(5-2)计算梯度精密度。对于四元梯度系统采用同样的方法分别测定 AB、AC、CD 、BC、BD 五组台阶梯度,每组重复三次。
 
 
5.3 系统延迟体积
 
设备与试剂同5.2.1。
 
测试方法参照5.2.2,先以100%流动相A,0.2 mL/min平衡系统,基线稳定后,按照表5设置梯度程序,启动程序采集检测器信号,记录谱图并保存。然后在谱图上读取基线上扬拐点(50%响应信号处)对应的时间t(min),按照公式(5-3)计算梯度系统延迟体积。
 

 
表5 系统延迟体积梯度设置表
 
5.4 密封性
 
参照4.1.3,测试点为压力上限90%,测试位置:(1)进样阀后,色谱柱前;(2)色谱柱后,检测池前。观察恒流泵压力降,滤纸检测是否有泄漏。
 
5.5 重复性
 
5.5.1 设备与试剂
 
色谱工作站一套,带 20uL 样品环(对于 UHPLC,选择 1uL 样品环)的手动进样阀一个(配自动进样器则不需要),合适规格的注射器一支(配自动进样器则不需要),C18 色谱柱一支(理论塔板数不低于 18000)或阻尼管;试样参见表 6;流动相为 85%甲醇水溶液(样品色谱峰保留因子 k 值不低于 3)或纯水。
 
5.5.2 测试方法
 
仪器整机系统(包括恒流泵、检测器、色谱柱、进样系统、色谱工作站等)连接好,按照仪器系统配置的检测器类型选择流动相等测试条件和参数,见表3和表6。 以85%甲醇水溶液为流动相,流量为1.0 mL/min,基线稳定后注入20 L相应的试样,记录保留时间和峰面积,连续7次。
 
注:对于UHPLC,色谱柱选择亚2um,2.1×50mm,流量设为0.2 mL/min,进样量为1uL。
 
分别将保留时间、峰面积测试数据代入式(5-4)计算定性、定量重复性RSD值。
 
 .................. (5-4)
 
式中:
 
RSD—定性、定量重复性相对标准偏差;
 
Xi—第i 次测得的保留时间或峰面积;
 
—n 次测量结果的算术平均值;
 
i—测量序号;
 
n—测量次数(n=7)。
 
5.6 检出限与定量限
 
设备与试剂同5.5.1,试样按照表6选择。
 
测试方法参照5.5.2,基线稳定后注入相应的试样,采集谱图,记录色谱图中试样的峰高和基线噪声,重复三次取平均值。然后按式(5-5)、(5-6)计算,作为仪器的检出限(S/N=3)与定量限(S/N=10)。
 
式中:
 
cLOD—检出限,mg/mL(以最小检出浓度计); cLOQ—定量限,mg/mL(以最小定量浓度计);
 
Ni—动态基线噪声,AU(或V);
 
c—样品浓度,mg/mL; H—样品峰高,AU(或V);
 
V—进样体积,μL;
 
注:式中的数字“20”为标准的进样体积,μL。
 
5.7 线性范围
 
设备与试剂同5.5.1,试样按照表6选择。
 
测试方法参照5.5.2,基线稳定后,由低到高,依次注入10个不同浓度相应的试样,采集谱图,每个浓度重复测试三次,取算术平均值。以前五个浓度点和对应峰面积作标准曲线,计算出后五点的理论峰面积,与对应含量的峰面积比较,峰面积刚好大于计算值5%时,认为曲线弯曲,此点浓度作为线性上限CH。 以5.6测得的检测限作为线性下限CL。最后,由CH/CL算出检测器线性范围。
 
 
表6 配置不同检测器时试样的选择
 
​注:仍未达到线性拐点,则需加大或减小试样浓度后继续进行测。


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